Kako delujejo testi za SARS-Cov-2?

Ker so virusi tako majhni, da jih niti z najboljšim svetlobnim mikroskopom ne moremo neposredno opazovati, so za njihovo zaznavanje in prepoznavanje razvili posebne, dokaj zapletene molekularne metode. Za vsakdanje množično dokazovanje prisotnosti virusa SARS-Cov-2 v odvzetih brisih uporabljamo predvsem dve tehnologiji:

• hitre antigenske teste, ki potrdijo prisotnost za virus značilne beljakovine iz ovojnice virusa in
• bolj zahtevne PCR teste, ki potrdijo prisotnost za virus značilnega zaporedja molekule RNK iz dednega materiala virusa.

(Poleg testov, ki v vzorcu brisa ugotavljajo prisotnost dednine ali beljakovine virusa, obstajajo tudi testi, ki v krvi zaznajo odziv telesa oziroma imunskega sistema na virus. S testi protiteles ne zaznavajo neposredno virusa, ampak ugotavljajo, ali je bil nekdo v preteklosti že okužen z virusom. Tovrstni testi potrdijo prisotnost protiteles, ki jih človeški imunski sistem tvori kot odziv na srečanje telesa z virusom.)

Kaj se dogaja z molekulami, ko izvajamo antigenski test?

Izvajanje antigenskih testov lahko primerjamo z opazovanjem potoka, po katerem teče voda. S testom želimo ugotoviti, ali je v vodi virus. Ker so virusni delci premajhni, da bi jih lahko neposredno opazovali, si pri njihovem zaznavanju pomagamo s posebnim lepilom, ki se lahko prilepi le na virus. Gre za molekule imenovane protitelesa, ki imajo takšno zgradbo, da se lahko pripnejo le na značilen del virusa (antigen), ki ga želimo zaznati.

Za izvedbo testa potrebujemo poleg lepila še plavajoče kroglice, ki jih lahko brez težav opazujemo, in dve vodni pregradi oziroma ribiški mreži, ki ju postavimo čez potok. Prva mreža ima večje luknje, tako da prepušča kroglice, druga pa je gostejša, zato kroglice zaustavi.

Nato le prvo mrežo, ki prepušča kroglice, premažemo s posebnim lepilom za viruse. Ta bo na mrežo prilepil viruse, ki bodo plavali mino. A žal tudi prilepljenih virusov neposredno ne moremo zaznati, zato so nam v pomoč kroglice, ki jih lahko vidimo. Trik, ki ga uporabimo za zaznavanje virusa je, da tudi kroglice, ki jih spuščamo po potoku, premažemo s posebnim lepilom za viruse.

V primeru, če je v vodi virus, se bodo virusni delci vezali na kroglice in kroglice z vezanim virusom se bodo zaustavile ne le na drugi mreži, ki kroglice v vsakem primeru ulovi (kontrolna črta C), ampak tudi na prvi mreži, ki nase lepi viruse (testna črta T). Prva mreža bo namreč lahko ujela nekatere viruse, ki so prilepljeni na kroglice, in tako zaustavila tudi kroglice. Kroglice se bodo v tem primeru začele nabirati na obeh mrežah, kar ustreza dvema črticama na testu. Rezultat testa je tako pozitiven.

Če v vodi ni virusa, se virusi ne bodo prilepili na kroglice, zato se kroglice ne bodo mogle zaustaviti na prvi mreži, ki je namazana z lepilom za viruse (testna črta T), ampak le na drugi mreži, ki v vsakem primeru zadrži kroglice (kontrolna črta C). Kroglice se bodo tako nabirale le v eni sami mreži, kar ustreza eni črtici na testu. V tem primeru je test negativen, saj virusa v vodi preko kroglic nismo zaznali.

Verižna reakcija s polimerazo kot osnova PCR testa

Bolj zahtevni za izvedbo kot antigenski so PCR testi, ki delujejo na osnovi pomnoževanja virusnega genetskega materiala, kar poteka s pomočjo verižne reakcije s polimerazo (odtod kratica PCR). Pri tej metodi zaznavamo virusno dednino oziroma informacijo, ki je shranjena v molekulah RNK, ki jih ima virus v svoji notranjosti. Med testom po posebnem postopku molekulo RNK najprej prepišemo v molekulo DNK, nato pa jo pomnožimo z metodo PCR.

Način delovanja verižne reakcije s polimerazo si najlaže predstavimo z analogijo. Genski zapis v obliki dolge dvojne vijačnice DNK lahko primerjajmo z besedilom, ki je natisnjeno v knjigi. Dokler je knjiga zaprta, je ne moremo ne brati ne prepisovati ne fotokopirati. Enako velja za DNK. Dokler je molekula v obliki dvojne vijačnice, so informacije v njej zgolj shranjene, ne morejo pa se kopirati oziroma kako drugače uporabljati. Šele razprta dvojna vijačnica, ko posamezni verigi nista več povezani v enotno vijačnico, postane berljiva in jo lahko po naši analogiji primerjamo z odprto knjigo. Vijačnico DNK zunaj žive celice razpremo preprosto tako, da jo za kratek čas segrejemo na temperaturo okoli 95 stopinj Celzija.

Z metodo PCR lahko kopiramo točno določene odseke v zapisu verige DNK, za katere poznamo zgradbo začetnega in končnega mesta v zapisu. Po naši analogiji z romanom je to enako, kot če bi želeli prepisati le del knjige, pri katerem poznamo samo začetni in končni stavek besedila. Kako bi to naredili? Recimo, da imamo posebne črke, ki se samodejno lepijo na besedilo v knjigi. Iz takih črk sestavimo dve zaporedji, ki se bosta sami nalepili na ustrezen začetni in končni stavek odseka romana ter tako označili del knjige, ki ga želimo razmnožiti.

V svetu molekul DNK ustreza takšnemu lepljivemu stavku umetno izdelan košček enojne molekule DNK, ki ga imenujemo začetni oligonukleotid. Ta se bo med segrevanjem prilepil na ustrezno mesto na razprti molekuli. Ko temperaturo spet znižamo, encimi polimeraze z ustreznimi nukleotidi oziroma genetskimi črkami zapolnijo tudi prostor med obema prilepljenima koščkoma. Tako smo podvojili del zaporedja DNK med prvim in zadnjim delom besedila v genskem zapisu, ki smo ga označili z lepljivima zaporedjema molekule DNK.

Ključno pri PCR reakciji je, da poteka verižno, kar pomeni, da se isti proces večkrat zaporedoma ponovi, čemur rečemo cikel. Pri vsaki ponovitvi se število kopij želenega odseka molekule DNK podvoji, tako da lahko teoretično dobimo po dvajsetih ponovitvah reakcije iz ene same molekule DNA več kot milijon njenih povsem enakih kopij.

Za izvedbo testa z metodo PCR je pomembno, da z dodajanjem pravih začetnih oligonukleotidov sprožimo pomnoževanje točno tistih molekul dednine, ki so značilne prav za virus, ki ga želimo prepoznati v vzorcu. Če teh molekul dednine v vzorcu ni, jih PCR ne bo mogel pomnožiti in rezultat testa bo zato negativen.

Ocenjevanje količine virusne dednine z metodo qPCR

Z metodo PCR lahko ocenimo tudi relativno količino virusne dednine v vzorcu. Ker se količina DNK v vsakem ponovljenem ciklu podvoji, lahko sklepamo, da je bilo več virusne dednine v tistem vzorcu, pri katerem smo v manj ciklih dosegli želeno mejno vrednost signala. Da pa lahko sproti spremljamo, kako se DNK pomnožuje, moramo uporabiti še en trik.

V vzorec dodamo posebno fluorescentno barvilo, ki začne svetiti, ko se molekula, na katero je barvilo vezano, pritrdi na molekulo DNK. Predstavljamo si lahko, da so v barvilu majhne lučke, ki se prižgejo le v primeru, ko se neposredno udeležijo procesa pomnoževanja DNK. Več kot se bo molekul DNK pomnožilo, več barvila oziroma lučk se bo prižgalo, zato bo začel vzorec močneje svetiti.

Pri kvantitativni metodi verižne reakcije s polimerazo (qPCR) lahko v realnem času spremljamo, kako močno vzorec sveti, in tako preko jakosti zaznane svetlobe posredno odčitavamo količino nastale dednine. Ko meritve nanesemo na graf, dobimo sprva eksponentno naraščanje, ki pa se sčasoma umiri, saj v vzorcu zmanjka materiala za izgradnjo novih kopij DNK, kar povzroči, da se proces zaključi. Takrat smo dosegli fazo platoja.

Če primerjamo krivulje naraščanja količine DNK za različne vzorce, ki smo jih izmerili z isto napravo, lahko ocenimo razlike v količini njihove dednine. Če se krivulja pri vzorcih razlikuje za 10 ciklov, lahko sklepamo, da je bila razlika v koncentraciji izvorne virusne dednine 2 na deseto potenco oziroma za faktor približno tisoč. Če se enak graf ponovi šele po dvajsetih ciklih, je bila razlika v koncentraciji 2 na dvajseto potenco ali za faktor približno milijon.

S testi RT-qPCR za SARS-CoV-2 pomnožujemo vzorec, dokler ne zaznamo dovolj močnega signala fluorescentnega barvila, kar je znak, da smo v vzorcu zaznali virusno dednino. V tem primeru je izid testa pozitiven. Če niti po velikem številu ponovitev vzorec ne začne svetiti, je to znak, da v vzorcu ni bilo virusne dednine. V tem primeru je izid testa negativen.

Število ciklov PCR, ki so bili potrebni, da je signal presegel mejo zaznave, včasih navedejo tudi na izvidu testa. Količino ciklov, ko fluorescentni signal doseže prag zaznave, označimo s kratico Ct (cycle threshold). Dejanski virus, ne le njegovo dednino, je raziskovalcem uspelo izolirati tudi iz vzorcev, pri katerih se je signal pojavil šele po več kot 36 ponovljenih ciklih, zato večina naprav za testiranje postavlja mejo za negativen rezultat pri še večjem številu ciklov. Zavedati pa se je treba, da je ta meja odvisna od posameznega postopka in ni univerzalno standardizirana.

Algoritem za interpretacijo testov

Prilagam še prevod sheme, s katero si lahko pomagate pri razumevanju rezultatov hitrih antigenskih testov v različnih okoliščinah. Algoritem so pripravili pri ameriškem uradu CDC, izvorna verzija v angleščini z obsežno razlago pa je na njihovi spletni strani: Interim Guidance for Antigen Testing for SARS-CoV-2.

-