Raziskave na področju ved o življenju, ki jih v angleščini označujemo kot “life sciences”, so v zadnjih desetletjih prevzele vodilno vlogo med znanstvenimi disciplinami. Med 25 velikimi znanstvenimi izzivi prihodnosti, ki so jih izbrali ob 125-letnici revije Science, je 15 izzivov s področja ved o življenju. Danes na tem področju deluje več znanstvenikov kot na kateremkoli drugem. Vzrok je nedvomno v veliki kompleksnosti živih organizmov, želji po razumevanju življenja, pa tudi potencialni uporabi rezultatov za izboljšanje življenja. Napredek na področju biokemije in molekularne biologije kot temeljev ved o življenju je bil v zadnjih desetletjih naravnost osupljiv in danes je težko opravljati raziskave brez uporabe metod, ki so se razvile šele pred desetimi ali petnajstimi leti. Najbrž je res bolj smiselno govoriti o znanostih o življenju kot ločeno o biokemiji, molekularni biologiji, biotehnologiji, genetiki in mikrobiologiji, saj danes v vseh naštetih vedah uporabljamo podobne metode raziskovanja (npr. metode rekombinantne DNA). Zato je tudi napovedovanje prihodnosti nehvaležno, saj lahko določena odkritja ali nove metode bistveno spremenijo podobo na tem področju. Vseeno tvegajmo s pregledom trendov, za katere menim, da bodo določali razvoj molekularne biologije v naslednjih desetih letih.
Zanimivo je, da je razvoj metod molekularne biologije potekal vzporedno z razvojem elektronike in računalništva. Določitev genoma (glej slovarček spodaj) bi bilo na primer popolnoma nemogoče z računalniki izpred dveh desetletij. V centrih za določanje genomov uporabljajo ene najzmogljivejših računalnikov na svetu in tudi trenutno najmočnejši superračunalnik na svetu, IBMov BlueGene, je namenjen simulacijam bioloških sistemov. Zahteve molekularne biologije spodbujajo razvoj novih, bolj zmogljivih inštrumentov, kot so spektrometri za jedrsko magnetno resonanco za določanje strukture proteinov in pa izjemno občutljivi masni spektrometri za identifikacijo proteinov, ki jih pod določenimi pogoji proizvajajo celice.
Instrumentalizacija je torej nedvomno trend, ki bo vse bolj oblikoval prihodnost, povečevala pa se bo tudi občutljivost naprav. Že danes lahko spremljamo in merimo interakcije med posameznimi molekulami (npr. z mikroskopom na atomsko silo ali z laserskimi ščipalkami), masni spektrometri lahko zaznavajo femtomolarne koncentracije (torej take, ki sodijo v velikostni razred okoli 10-15 mol/l) in to ob hitrosti do tisoč vzorcev na uro. Že sedaj lahko zaznavamo tudi praktično posamezne molekule DNA.
Vzporedno z večanjem občutljivosti se dogajata miniaturizacija in paralelizacija pristopov. V marsikaterem pogledu gre za avtomatizacijo, lahko bi rekli celo industrializacijo, z vzporednim opravljanjem velikega števila analiz. In če rečem velikega, s tem res mislim velikega – od desettisočev do več kot milijona vzorcev v najnovejših prototipih mikromrež (glej npr. sliko v članku G. Serše v septembrski številki Proteusa). Podobni so pristopi na osnovi multipleksinga, vzporednega določanja biološke aktivnosti stotin ali tisočev proteinov in vzporedne sinteze in analize biološke aktivnosti kemijskih spojin, kar predstavlja pomemben pristop predvsem v iskanju novih zdravil. Miniaturizacija in avtomatizacija bosta v naslednjem desetletju prodrli v laboratorije tudi pri izvajanju manipulacije z metodami rekombinantne DNA v miniaturnih laboratorijih na čipih, kjer s pomočjo elektronike usmerjamo, kombiniramo in izvajamo reakcije s pikolitri (10-12 litra) reagentov.
Pomembna posledica prodora novih in bolj zmogljivih inštrumentov je, da so ti pogosto izjemno dragi (njihove cene dosegajo milijone ali desetine milijonov evrov), hkrati pa zahteva izraba vseh njihovih zmogljivosti visoko usposobljene specialiste, zato se vedno bolj pojavljajo infrastrukturni centri, ki opravljajo določene meritve za skupnost raziskovalcev. To dejstvo bo skupaj z globalizacijo v naslednjem desetletju še bolj izraženo. Že danes lahko nekatere analize ali reagente naročimo pri specializiranih laboratorijih kjerkoli v svetu; to velja za določanja nukleotidnih zaporedij, sintezo peptidov ali oligonukleotidov in pripravo protiteles. Nedvomno pa bo postalo bolj običajno in učinkovito, če bomo infrastrukturnim laboratorijem prepustili nekatere najzahtevnejše analize, kot so npr. analiza izražanja proteinov v določenih tkivih, priprava živali z izbitimi geni, priprava rekombinantnih proteinov in določanje njihovih tridimenzionalnih struktur. Na ta način bo ostalo več časa in energije za kreativnost in inovativne ideje, saj se ne bo potrebno ukvarjati z zahtevnim “obrtniškim delom”.
Danes količina biološke informacije na vseh področjih narašča eksponentno. To velja za podatke o nukleotidnih zaporedjih v genomu, o tridimenzionalnih strukturah proteinov in celo za število objavljenih člankov. Samo revija Journal of Biological Chemistry ima letni obseg že preko 56,000 strani, kar pomeni, da že dolgo nihče ne more spremljati, kaj šele obvladovati vsega znanja na področju biokemije. V molekularno bioloških in tudi biokemijskih raziskavah je vedno večji pomen na kontekstu raziskav v živem sistemu. Ob povečanem obsegu informacij je eden pomembnejših trendov tudi povezovanje različnih nivojev delovanja bioloških sistemov – od strukture bioloških molekul preko njihovih interakcij, delovanja funkcionalno povezanih sistemov (npr. poti signalizacije ali metabolizma), nadalje delovanja celic, skupin celic v celičnih sistemih in tkivih, pa do celotnega organizma in interakcij med organizmi. Danes imajo sicer metode mikromrež še precej otroških bolezni, tako da je rezultate potrebno potrditi z drugimi metodami, vendar lahko pričakujemo, da bodo te težave v nekaj letih odpravljene. Drugače pa je z interpretacijo rezultatov tovrstnih eksperimentov.
Prav to se danes kaže kot najtrši oreh in največji izziv za bioinformatiko kot orodje za organizacijo in predvsem vzročno-posledično ureditev podatkov. Pogosto zasledimo slepo zaupanje v bioinformatiko in sistemsko biologijo, ki da naj bi z analizo vseh razpoložljivih podatkov (ki jih je res veliko) sama od sebe generirala model delovanja celice. To me nekoliko spominja na evforijo ob razvoju umetne inteligence pred nekaj desetletji, ki pa se je izkazala za precej jalovo. Tudi Nobelov nagrajenec Sidney Brenner je v eseju Sillycon valley fever podvomil o slepem zaupanju tehnologiji. Tako za postavljanje inovativnih hipotez in razumevanje delovanja bioloških sistemov kot za kritično branje člankov bodo še vsaj naslednjih deset let zagotovo potrebni biokemiki. Seveda pa ima bioinformatika izjemno pomembno vlogo pri organizaciji velike količine informacij in njihovem povezovanju. Človeški možgani težko obvladujejo večdimenzionalne probleme in pri razmišljanju raje obravnavamo vsako spremenljivko posebej, zato nam obdelava z računalnikom bistveno olajša delo.
V naslednjem desetletju se bo genomu, ki je danes že določen pri človeku in več kot 300 drugih organizmih, ter transkriptomu (glej slovarček spodaj), ki predstavlja največji delež podatkov v zbirkah nukleotidnih zaporedij, pridružilo še veliko druge informacije, ki bo tvorila pomembno infrastrukturo za razumevanje delovanja živih organizmov. Omenimo samo dva izmed pomembnejših “-omov”:
Interaktom – to je zbirka vseh medsebojnih interakcij proteinov določenega organizma med sabo. Interaktom kvasovke je v veliki večini določen, pri človeku pa so znane interakcije znotraj dobre desetine proteinov. V tovrstnih zbirkah manjka še precejšen del proteinov oz. njihovih interakcij, predvsem membranskih. Poleg tega opažene interakcije, določene večinoma s pomočjo dvohibridne interakcije kvasovke (Y2H) kažejo na možnost (ni pa to nujno), da pride do teh interakcij znotraj celice dejansko tudi zaradi razlik v lokalizaciji, časovnem izražanju in podobno. Pri kvasovki so prav s pomočjo interaktoma ugotovili funkcijo za več kot polovico od 2557 proteinov z dotlej neznano funkcijo. Nekateri ocenjujejo, da je v človeških celicah okrog 200,000 interakcij med proteini, po drugi oceni pa naj bi bilo različnih tipov interakcij okrog 10,000. Določitev interaktoma bo precej težja kot določanje genoma, ki ima definirano velikost in pri katerem smo vedeli, koliko manjka do cilja. Interakcije se lahko pojavljajo med različnim številom partnerjev in jakost njihove interakcije sega preko devetih desetiških velikostnih razredov, zato je ob metodi dvohibridne interakcije potrebno uporabiti za določanje interakcij še druge pristope, kot so z masna spektrometrija, proteinski čipi, plazmonska resonanca itd.
Strukturni genom – splošno sprejeto mnenje je, da se proteini lahko zvijejo v omejeno število tridimenzionalnih vzorcev, ki naj bi bilo nekaj tisoč. Danes lahko postavimo dokaj zanesljive strukturne modele za skoraj dve tretjini od poldrugega milijona znanih proteinov, z določitvijo strukture nadaljnjih 10-15,000, idealno čimbolj različnih proteinov v okviru projekta strukturne genomike pa ocenjujejo, da bo ta delež presegel 90%. Določanje struktur predstavnikov novih družin je dobra investicija v prihodnost – na osnovi le 53 novih določenih struktur so denimo lahko postavili strukturni model za kar 24,113 proteinov. Določanje strukture je namreč bistveno bolj zamudno od določanja nukleotidnega zaporedja, zato se razkorak med številom znanih zaporedij (več kot 1.5 milijona) in struktur (25,000) samo še povečuje. Model strukture proteina lahko pogosto pripomore k razumevanju biološke vloge, npr. vpliva mutacij, ki povzročajo bolezni. Določitev strukture velikega števila različnih proteinov bo kot kaže prej vodila do napovedovanja struktur na osnovi zaporedja kot napovedovanje na osnovi fizikalnih principov, pa čeprav bi za te namene uporabili prej omenjene superračunalnike. Razlog je v tem, da preprosto še vedno ne razumemo nekaterih mogoče sicer zelo enostavnih zakonitosti, ki določajo zvitje proteinov.
Težko je izbrati največje posamezne izzive v biokemiji in molekularni biologiji, za katere lahko pričakujemo, da bodo rešeni v naslednjem desetletju. Zagotovo je pomembno najti zdravila za številne bolezni, posebej ko je ali bo na voljo informacija o primarni in kmalu tudi o terciarni strukturi tarč in njihovih interakcij. Žal pa kljub poznavanju genomov patogenih mikroorganizmov in človeškega genoma opažamo celó stagnacijo v registraciji novih zdravil. Ta zastoj je v večji meri posledica poslovnih odločitev farmacevtskih družb in zaostrenih pogojev regulacije novih zdravil kot pa nemoči znanstvenikov. Zagotovo lahko v naslednjem desetletju pričakujemo poleg novih zdravil tudi uporabo biokemije na drugih področjih človekovega življenja, denimo pri bolj učinkovitem izkoriščanju naravnih surovin in pri encimsko katalizirani sintezi kemijskih spojin, ki bo proizvajala bolj čiste produkte z manj okolju škodljivimi posledicami. Z zanimanjem bomo spremljali in sodelovali pri odkrivanju nekaterih bistvenih vprašanj: Kakšna je vloga proteinskih agregatov pri Alzheimerjevi bolezni in prionskih boleznih – so proteinski agregati zares povzročitelji bolezni ali le stranska posledica? Kakšna je dejansko strukturna koda, skrita v aminokislinskem zaporedju, da lahko proteini kljub številnim mutacijam obdržijo svojo strukturo? Zadnje raziskave nakazujejo, da vzorec zvitja proteina določajo interakcije med le majhnim številom parov ključnih aminokislin, ki jih lahko identificiramo iz večjega števila homolognih zaporedij.
Poglejmo, kakšne izzive si je postavil Craig Venter, človek, ki je z določitvijo genoma (dve tretjini določenega sta njegova osebna zasluga) premaknil mejnike sodobne molekularne biologije. Naslednja mejnika na njegovem seznamu izzivov sta katalog vseh genov na Zemlji ter ustvarjenje samostojno živečega organizma organizma z minimalnim genomom. Na lovu za morskimi mikroorganizmi so v Sargaškem morju identificirali novih 1800 organizmov, od tega 150 bakterij, in določili več kot milijon novih genov. Najmanjši danes znan mikroorganizem Mycoplasma genitalium vsebuje 470 genov in od približno 300 tistih, ki so potrebni za preživetje bakterije, za več kot 100 niti približno ne vemo, kakšno funkcijo imajo. Izziva, ki ju je postavil Venter, sta bržkone otročje lahka v primerjavi z vprašanji o delovanju možganov, molekulskega mehanizma spomina in zavesti na medceličnem nivoju, vendar ta vprašanja verjetno sodijo med izzive naslednjega stoletja.
Edina stvar, ki nas na področju biokemije in molekularne biologije v naslednjem desetletju vsekakor ne bi smela presenetiti, so sama presenečenja, ki bodo nasprotovala splošno sprejetemu mnenju in drzno prestavljala meje možnega.
(Roman Jerala)
Osnovni “-omi” biokemije in molekularne biologije:
- Genom – Celoten dedni zapis nekega organizma (pri veliki večini organizmov v obliki molekule DNA, pri nekaterih virusih pa v obliki molekule RNA).
- Transkriptom – Ribonukleinska kislina, ki nastane s prepisom aktivnega dela genoma. Večinoma predstavlja gene, ki kodirajo zgradbo proteinov. Transkriptom se razlikuje od celice do celice in se spreminja s spremembo pogojev v okolju, npr. med zdravim in bolnim tkivom. Ocenjujejo, da se pri človeku v RNA prepiše manj kot pet odstotkov DNA.
- Proteom – Nabor vseh proteinov, ki jih izraža določena celica pod določenimi pogoji. Proteini nastanejo s prepisovanjem mRNA (ene od vrst RNA), vendar količina proteina ni nujno sorazmerna s količino mRNA zaradi vpliva življenjske dobe mRNA ter proteinov samih. Proteom vključuje tudi vse modifikacije proteinov, ki nastanejo po prepisovanju, zato je število različnih proteinov bistveno večje od števila različnih genov.
- Interaktom – Nabor vseh interakcij med vsemi proteini organizma.
- Strukturni genom – Tridimenzionalne strukture vseh proteinov, oziroma vsaj nabor tridimenzionalnih struktur, na osnovi katerih lahko pripravimo strukturne modele vseh proteinov.
O avtorju: Prof. dr. Roman Jerala je vodja Laboratorija za biotehnologijo na Kemijskem inštitutu. Področje njegovega raziskovalnega dela so medicinsko pomembni procesi, predvsem imunski odziv na bakterijske infekcije, istočasno pa predava Bioinformatiko študentom biokemije na Univerzi v Ljubljani.
Slike:
Najnovejši 800 MHz spektrometer za magnetno resonanco, ki bo začel obratovati konec leta 2005 na Kemijskem inštitutu v Ljubljani. Namenjen bo predvsem strukturnim raziskavam bioloških makromolekul in zdravil.
Mreža 5133 povezav med 2037 človeškimi proteini, povezanimi s transkripcijskim faktorjem NF-κB, ki se aktivira ob vnetju. Povezave so predstavljene s programom Cytoscape 2.1.
