Razvoj tehnologije CRISPR/Cas9, ki omogoča spreminjanje genetskega zapisa vseh živih bitij, je revolucionaliziral področje molekularne biologije in genetike. Metodo je prestižna revija Science razglasila za največji preboj v znanosti v letu 2015, saj ta prinaša nove možnosti, npr. pri uvedbi personaliziranih terapij v medicini, zaščiti ogroženih živalskih in rastlinskih vrst, izogibanju uporabi toksičnih pesticidov in herbicidov ter kontrolo bolezni, ki se prenašajo z vektorji (npr. komarji).
Kaj je CRISPR?
Sistem CRISPR, kar je okrajšava za »Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats«, skupaj z geni cas predstavlja mehanizem pridobljene imunosti, ki ga za zaščito pred virusi, plazmidi (majhne krožne DNK molekule) in drugimi tujimi nukleinskimi kislinami uporabljajo številne bakterije in arheje. Arheje so skupina bakterijam podobnih mikroskopskih enoceličnih prokariontov, torej živih bitij, ki nimajo jedra in ostalih organelov, ki so značilni za živalske in rastlinske celice. CRISPR sestavlja zaporedje kratkih ponavljajočih se sekvenc (23-44 nukleotidov) in vmesniki podobne dolžine (Slika 1). Slednji vsebujejo unikatne sekvence, ki običajno izhajajo iz virusne ali plazmidne DNK in s pomočjo teh se bakterije ter arheje zaščitijo prej tujo nukleinsko kislino.
Od raziskav o slanoljubnih bakterijah in biološkem orožju do odkritja sistema CRISPR
Franscisco Mojica je bil leta 1989 doktorski študent na univerzi v španskem mestu Alicante, kjer je raziskoval genom slanoljubne arheje Haloferax mediterranei. Ugotovil je, da restrikcijski encimi, ki delujejo kot molekularne škarje, DNK razrežejo na ponavljajoče se 30 nukleotidov dolge sekvence, med njimi pa je odkril vmesnike, dolge približno 36 nukleotidov. Kmalu je odkril podobne ponovitve v sorodni arheji Haloferax volcanii. Da bi odkril kakšna je vloga sekvenc in ponovitev, se je lotil temeljitega pregleda obstoječe literature in našel znanstveni članek japonske raziskovalne skupine, ki je leta 1987 objavila, da so podobna ponavljajoča se zaporedja našli tudi v bakteriji Escherichia coli.
Mojica je nadaljeval z analizami genoma tudi pri drugih mikroorganizmih in do leta 2000 je našel tovrstna zaporedja kar v 20 različnih mikroorganizmih. Glede na to, da so CRISPR odkrili v številnih različnih vrstah bakterij in arhej, je Mojica sklepal, da mora imeti to zaporedje pomembno biološko vlogo. S pomočjo bioinformacijskih orodij je pokazal, da številna izmed the zaporedij ustrezajo zapisu za virus ali plazmid, ki napada izbrano bakterijo ali arhejo ter s tem pokazal, da CRISPR lokus nosi navodila za pridobljeni imunski sistem, ki ščiti bakterije in arheje pred določenimi okužbami.
Približno 1100 km stran od Francisca Mojice pa je ravno tako leta 1987 začenjal samostojno kariero Gilles Vergnaud, ki je imel nalogo, da vzpostavi prvi molekularno-biološki laboratorij za francosko Ministrstvo za obrambo. V poznih 90-ih letih je njegov laboratorij zaradi poročil, da naj bi režim Saddama Husseina razvijal biološka orožja, preusmeril pozornost s humane genetike na forenzično mikrobiologijo. Skupaj s pariškim univerzitetnim Inštitutom za genetiko in mikrobiologijo je pričel razvijati metodo, ki bi omogočila razlikovanje med bakterijami na podlagi genetskega zaporedja. Pri genetski analizi bakterije Yersinia pestis, povzročiteljici kuge, so našli lokus CRISPR. Podobno kot Francisco Mojica, je tudi Gilles Vergnaud predpostavil, da CRISPR predstavlja obrambni mehanizem bakterij.
Raziskave o kvarljivcih mlečnih izdelkov so razkrile tudi mehanizem sistema CRISPR
Philippe Horvath se je po doktoratu iz mikrobne genetike zaposlil v podjetju DuPont, znanemu danskemu proizvajalcu mlečnih izdelkov. Njegova naloga je bila ugotoviti, katere bakterije in virusi, ki okužujejo te bakterije (bakteriofagi), povzročajo neželene okužbe industrijskih bakterijskih kultur, ki so jih uporabljali pri pripravi mlečnih izdelkov.
Horvath je v raziskavi uporabil metodo CRISPR za analizo industrijsko pomembnih bakterij in tako kot Mojica ter Vergnaud, je tudi on opazil, da obstaja povezava med vmesniki in odpornostjo bakterij proti bakteriofagom. Njegovi raziskavi sta se leta 2005 priključila še raziskovalca Rodolphe Barrangou in Sylvain Moineau in skupaj so pokazali, da vmesniki nosijo zapis za odpornost proti določenemu bakteriofagu. Nadalje, pokazali so, da če se zapis vmesnika spremeni le za en bazni par, potem bakterija ni bila več odporna proti temu bakteriofagu. S tem so potrdili, da je imunost, ki temelji na sistemu CRISPR, odvisna od sekvence DNK.
K razvoju tehnologije CRISPR/Cas9, ki jo danes v laboratorijih uporabljajo številni raziskovalci, so nato prispevali tudi mnogi drugi znanstveniki, med drugim John van der Oost, ki je prvi programiral CRISPR, da je v bakteriji E. coli targetirala točno določene gene bakteriofaga in Luciano Marraffini, ki je ugotovil, da CRISPR reže ravno DNK. Sledil je Virginijus Siksnys, ki je prvi pokazal, da bi lahko sistem CRISPR/Cas9 programirali tako, da bi ta rezala DNK na izbranem, točno določenem mestu. Znanje, pridobljeno s temi raziskavami in številnimi drugimi, sta nato uporabili Jennifer Doudna in Emmanuelle Charpentier, ki sta razvili tehnologijo CRISPR/Cas9 za spreminjanje bakterijskih genov ter Feng Zhang, ki je razvil tehnologijo CRISPR/Cas9, s katero je spreminjal genom sesalskih celic.
Francisco Mojica, Gilles Vergnaud in Philippe Horvath na začetku svojih raziskav zagotovo niso pričakovali, da bodo ravno ta odkritja tlakovala pot do nastanka tako mogočne metode. Zgodba o razvoju tehnologije CRISPR/Cas9 je samo eden izmed primerov, ki pokažejo, da vlaganje v znanost in razvoj vodi do nepredvidljivih odkritij, ki se lahko šele desetletja pozneje izkažejo za ključna pri razvoju novih tehnologij.
Viri
- Lander ES. 2016. The heroes of crispr. Cell. 164(1-2):18-28.
- Horvath P, Barrangou R. 2010. Crispr/cas, the immune system of bacteria and archaea. Science. 27(5962):167-170.
- Rath D, Amlinger L, Rath A, Lundgren M. 2015. The crispr-cas immune system: Biology, mechanisms and applications. Biochimie. 117:119-128.
