Določanje količine gensko spremenjenih organizmov (GSO) v živilih ni ravno enostavno početje. Če pustimo ob strani smiselnost tovrstnih analiz, saj je stroka večinsko prepričana, da uživanje take hrane za zdravje ni škodljivo, veljajo na ravni Evropske unije zaradi pritiska javnosti še vedno zelo stroga pravila glede trgovanja z GSO in njihovega gojenja. Živila in krma, ki vsebujejo več kot 0,9 odstotka dovoljenih gensko spremenjenih organizmov, morajo biti v Sloveniji in EU obvezno označeni. GSO, ki niso posebej odobreni, pa v hrani in krmi ne sme biti.
A kako lahko sploh vemo, da so v nekem živilu prisotni gensko spremenjeni organizmi? Proces določanja deleža GSO v posameznem vzorcu živila lahko primerjamo z določanjem deleža rjavega fižola v mešanici fižola različnih barv. Če želimo izračunati delež rjavega fižola v mešanici, moramo prešteti tako število zrn rjavega fižola kot tudi število vseh zrn v mešanici. Podobno moramo pri postopku določanja deleža GSO v vzorcu prešteti tako zaporedja DNK, ki so značilna za GSO, kot tudi zaporedja DNK, ki so značilna za posamezno biološko vrsto.
V nasprotju s štetjem zrn fižola pa štetje zaporedij DNK oziroma določanje njihove količine ni preprosto. Da bi jih sploh lahko šteli, jih moramo najprej pomnožiti po posebnem postopku, imenovanem verižna reakcija s polimerazo (PCR).
Metoda za pomnoževanje molekul DNK
Način delovanja metode PCR si najlaže predstavimo z analogijo. Genski zapis v obliki dolge dvojne vijačnice DNK lahko primerjajmo z besedilom, ki je natisnjeno v knjigi. Dokler je knjiga zaprta, je ne moremo ne brati ne prepisovati ne fotokopirati. Enako velja za DNK. Dokler je molekula v obliki dvojne vijačnice, so informacije v njej zgolj shranjene, ne morejo pa se kopirati oziroma kako drugače uporabljati. Šele razprta dvojna vijačnica, ko posamezni verigi nista več povezani v enotno vijačnico, postane berljiva in jo lahko po naši analogiji primerjamo z odprto knjigo. Vijačnico DNK zunaj žive celice razpremo preprosto tako, da jo za kratek čas segrejemo na temperaturo okoli 95 stopinj Celzija.
Z metodo PCR lahko kopiramo točno določene odseke v zapisu verige DNK, za katere poznamo zgradbo začetnega in končnega mesta v zapisu. Po naši analogiji z romanom je to enako, kot če bi želeli prepisati le del knjige, pri katerem poznamo samo začetni in končni stavek besedila. Kako bi to naredili? Recimo, da imamo posebne črke, ki se samodejno lepijo na besedilo v knjigi. Iz takih črk sestavimo dve zaporedji, ki se bosta sami nalepili na ustrezen začetni in končni stavek odseka romana ter tako označili del knjige, ki ga želimo razmnožiti.
V svetu molekul DNK temu lepljivemu stavku ustreza kratek umetno narejen košček enojne molekule DNK, ki se prilepi na ustrezno mesto na razprti molekuli. Ko temperaturo spet znižamo, se koščka nalepita na molekulo in omogočita, da encimi z ustreznimi molekulami zapolnijo tudi prostor med obema koščkoma. Tako smo podvojili del zaporedja DNK med prvim in zadnjim delom besedila v genskem zapisu, ki smo ga označili z lepljivima koščkoma DNK.
Ključno pri reakciji je, da poteka verižno, kar pomeni, da se isti proces večkrat zaporedoma ponovi. Pri vsaki ponovitvi se število kopij želenega odseka podvoji, tako da lahko teoretično dobimo po zgolj dvajsetih ponovitvah reakcije iz ene same molekule DNA več kot milijon njenih povsem enakih kopij.
Kako določimo količino posameznih genov v vzorcu
Ena izmed različic metode PCR, ki poleg pomnoževanja omogoča tudi določanje količine DNK v vzorcu, je verižna reakcija s polimerazo v realnem času (qPCR). Pri qPCR izmerimo količino posameznega zaporedja DNK v vzorcu tako, da primerjamo hitrost pomnoževanja DNK v neznanem vzorcu s hitrostjo pomnoževanja za vzorec, ki ga natančno poznamo. Iz dobro ovrednotenega referenčnega materiala pripravimo umeritveno krivuljo, ki jo primerjamo s krivuljami hitrosti pomnoževanja za nove vzorce. S tako primerjavo lahko določimo količino posameznih zaporedij DNK v vzorcu.
V primeru določanja količine GSO moramo analizo izvesti dvakrat. Najprej pomnožimo zaporedje DNK, značilno za GSO, in nato še zaporedje, ki je značilno za biološko vrsto. Delež GSO nato določimo s primerjavo izmerjenih vrednosti za obe zaporedji.
Žal pa metoda qPCR ni primerna za vse vrste vzorcev, saj pri vzorcih, ki vsebujejo nizke količine DNK ali imajo preveč nečistoč, ni dovolj zanesljiva. Z novim pristopom, imenovanim digitalna verižna reakcija s polimerazo (dPCR), se je možnost zanesljivega določanja količine DNK povečala tudi v že bolj predelanih živilih.
Pri dPCR vzorec razdelimo na tako majhne podvzorce, da je v vsakem podvzorcu oziroma kapljici le po ena molekula DNK. V praksi jih je lahko tudi več, a take primere znamo ustrezno ovrednotiti s pomočjo statistične analize. Nato vsakega od podvzorcev pomnožimo po metodi PCR. Ker z ustreznimi začetnimi zaporedji DNK poskrbimo, da se bo pomnoževalo samo iskano zaporedje DNK, bo do pomnoževanja prišlo samo v podvzorcih, ki vsebujejo iskano zaporedje DNK.
Pri metodi dPCR za določanje količine DNK tako ne potrebujemo primerjanja z referenčnimi materiali, saj lahko po izvedeni reakciji preprosto preštejemo vse podvzorce, ki so se pomnožili, ter tako določimo količino iskane DNK v vzorcu. Pri določanju vsebnosti GSO po metodi dPCR ločeno določimo količino DNK, značilno za GSO, in količino DNK, ki je lastna oziroma značilna za posamezno biološko vrsto. Razmerje teh dveh števil ustreza deležu GSO v vzorcu.
Slovensko znanje pri razvoju najdražjega zdravila na svetu
Metode, ki so jih razvili za določanje količine GSO v živilih, pa niso uporabne le za namen nadzora nad gensko spremenjenimi organizmi. Raziskovalci Nacionalnega inštituta za biologijo iz Ljubljane so nedavno prav zato, ker imajo bogate izkušnje na področju metod za določanje količine GSO v živilih in krmi, sodelovali pri razvoju procesov za proizvodnjo trenutno najdražjega zdravila na svetu.
Biotehnološkemu podjetju AveXis iz skupine Novartis je ameriška Agencija za hrano in zdravila (FDA) konec maja 2019 za zdravljenje dojenčkov s spinalno mišično atrofijo, starih manj kot dve leti, odobrila gensko zdravilo zolgensma. Gre za hudo živčno-mišično bolezen, za katero je značilna izguba motoričnih nevronov, kar vodi do progresivne mišične šibkosti in paralize. Žal pa stane posamezna terapija z novim genskim zdravilom neverjetnih 2,1 milijona dolarjev, zato velja zolgensma za trenutno najdražje zdravilo na svetu.
Sodobna zdravila za gensko terapijo omogočajo popravljanje napak v človekovih genih in s tem zdravljenje genskih bolezni. V nasprotju s klasičnimi zdravili ne vsebujejo kemijskih spojin, ampak viruse, ki služijo kot dostavna vozila za nadomestne zdrave gene. Za uporabo v genski terapiji so pomembni gensko spremenjeni z adenovirusi povezani virusi (AAV), ker lahko njihovi različni sevi dostavijo pakete v različna tkiva telesa. Z izborom posameznega seva lahko dostavimo zdravilo v točno določeno izbrano tkivo. Virus AAV v humane celice zelo učinkovito prenese zdrave gene, kjer nadomestijo nedelujoče gene, ki povzročajo bolezen.
Eden glavnih izzivov pri razvoju zdravil za gensko terapijo z virusnimi prenašalci je vzpostavitev procesa za njihovo industrijsko proizvodnjo. To zahteva optimizacijo postopkov gojenja virusov v celicah, njihovega čiščenja, analitskih metod, ki omogočajo sledenje kvalitete proizvodnega procesa, kot tudi natančno karakterizacijo virusa.
Prav tehnologija čiščenja je eden ključnih procesov v proizvodnji bioloških zdravil, saj moramo s tem procesom ločiti zdravilno učinkovino od drugih, pogosto strupenih ali celo rakotvornih snovi. Pri razvoju procesa čiščenja zdravila zolgensma je s svojo tehnologijo pametnih filtrov sodelovalo biotehnološko podjetje BIA Separations iz Ajdovščine. V slovenskem podjetju so razvili učinkovit postopek za čiščenje virusov AAV, ki je postal del procesa proizvodnje novega zdravila za gensko terapijo.
Preden zdravnik zdravilo injicira v bolnika, mora pri genski terapiji poznati tudi število terapevtskih virusov v posamezni dozi zdravila. Prav glede tega pa se kot zelo koristno izkaže znanje določanja količine DNK v vzorcih. Pri merjenju količine GSO v hrani in določanju števila terapevtskih virusov v dozi zdravila gre za podobne metode, s katerimi imajo raziskovalci Nacionalnega inštituta za biologijo veliko izkušenj, zato so jih povabili, da sodelujejo pri razvoju procesov za proizvodnjo in kontrolo kakovosti trenutno najdražjega zdravila na svetu.
Viri
- Vpeljava novih metod za določanje količine GSO v živilih
- Raziskovalci NIB sodelovali pri razvoju procesov za proizvodnjo najdražjega zdravila na svetu
- BIA Separations selected for manufacturing process development support for gene therapy pipeline
