Ker so virusi tako majhni, da jih niti z najboljšim mikroskopom ne moremo neposredno opazovati, so za njihovo zaznavanje in prepoznavanje razvili posebne, dokaj zapletene metode. Za vsakdanje dokazovanje prisotnosti virusa SARS-Cov-2 v odvzetih brisih uporabljajo predvsem dve tehnologiji:
- PCR teste, ki potrdijo prisotnost za virus značilnega zaporedja molekule RNK iz dednega materiala virusa in
- antigenske teste, ki potrdijo prisotnost za virus značilne beljakovine iz ovojnice virusa.
Poleg testov, ki v vzorcu brisa ugotavljajo prisotnost dednine ali beljakovine virusa, obstajajo tudi testi, ki v krvi zaznajo odziv telesa oziroma imunskega sistema na virus. S testi protiteles ne zaznavajo neposredno virusa, ampak ugotovijo, ali je bil nekdo v preteklosti že okužen z virusom. Tovrstni testi potrdijo prisotnost protiteles, ki jih človeški imunski sistem tvori kot odziv na srečanje telesa z virusom.
Kako deluje PCR test?
Trenutno najbolj zanesljivi testi delujejo na osnovi verižne reakcije s polimerazo (PCR). Pri tej metodi zaznavamo virusno dednino oziroma informacijo, ki je shranjena v molekulah RNK, ki jih ima virus v svoji notranjosti. Med testom po posebnem postopku molekulo RNK najprej prepišemo v molekulo DNK, nato pa jo pomnožimo z metodo PCR.
Način delovanja metode PCR si najlaže predstavimo z analogijo. Genski zapis v obliki dolge dvojne vijačnice DNK lahko primerjajmo z besedilom, ki je natisnjeno v knjigi. Dokler je knjiga zaprta, je ne moremo ne brati ne prepisovati ne fotokopirati. Enako velja za DNK. Dokler je molekula v obliki dvojne vijačnice, so informacije v njej zgolj shranjene, ne morejo pa se kopirati oziroma kako drugače uporabljati. Šele razprta dvojna vijačnica, ko posamezni verigi nista več povezani v enotno vijačnico, postane berljiva in jo lahko po naši analogiji primerjamo z odprto knjigo. Vijačnico DNK zunaj žive celice razpremo preprosto tako, da jo za kratek čas segrejemo na temperaturo okoli 95 stopinj Celzija.
Z metodo PCR lahko kopiramo točno določene odseke v zapisu verige DNK, za katere poznamo zgradbo začetnega in končnega mesta v zapisu. Po naši analogiji z romanom je to enako, kot če bi želeli prepisati le del knjige, pri katerem poznamo samo začetni in končni stavek besedila. Kako bi to naredili? Recimo, da imamo posebne črke, ki se samodejno lepijo na besedilo v knjigi. Iz takih črk sestavimo dve zaporedji, ki se bosta sami nalepili na ustrezen začetni in končni stavek odseka romana ter tako označili del knjige, ki ga želimo razmnožiti.
V svetu molekul DNK temu lepljivemu stavku ustreza kratek umetno narejen košček enojne molekule DNK (začetni oligonukleotid ali primer), ki se prilepi na ustrezno mesto na razprti molekuli. Ko temperaturo spet znižamo, se koščka nalepita na molekulo in omogočita, da encimi z ustreznimi molekulami zapolnijo tudi prostor med obema koščkoma. Tako smo podvojili del zaporedja DNK med prvim in zadnjim delom besedila v genskem zapisu, ki smo ga označili z lepljivima koščkoma DNK.
Ključno pri reakciji je, da poteka verižno, kar pomeni, da se isti proces večkrat zaporedoma ponovi. Pri vsaki ponovitvi se število kopij želenega odseka molekule DNK podvoji, tako da lahko teoretično dobimo po zgolj dvajsetih ponovitvah reakcije iz ene same molekule DNA več kot milijon njenih povsem enakih kopij.
Za izvedbo testa po metodi PCR je pomembno, da z dodajanjem pravih začetnih oligonukleotidov sprožimo pomnoževanje točno tistih molekul dednine, ki so značilne prav za virus, ki ga želimo prepoznati v vzorcu. Če teh molekul dednine v vzorcu ni, jih PCR ne bo mogel pomnožiti in rezultat testa bo zato negativen.
Ocenjevanje količine virusne dednine z metodo qPCR
Z metodo PCR lahko ocenimo tudi relativno količino virusne dednine v vzorcu. Ker se količina DNK v vsakem ciklu podvoji, lahko sklepamo, da je bilo več virusne dednine v tistem vzorcu, pri katerem smo v manj ciklih dosegli želeno mejno vrednost signala. Da pa lahko sproti spremljamo, kako se DNK pomnožuje, moramo uporabiti še en trik.
V vzorec dodamo posebno fluorescentno barvilo, ki začne svetiti, ko se molekula, na katero je barvilo vezano, med PCR procesom pritrdi na molekulo DNK. Predstavljamo si lahko, da so v barvilu majhne lučke, ki se prižgejo le v primeru, ko se neposredno udeležijo procesa pomnoževanja DNK. Več kot se bo molekul DNK pomnožilo, več barvila oziroma lučk se bo prižgalo, zato bo začel vzorec močneje svetiti.
Metodo imenujemo PCR v realnem času, saj lahko veš čas spremljamo, kako močno vzorec sveti, preko jakosti zaznane svetlobe pa posredno odčitavamo tudi količino nastale dednine. Če meritve nanašamo na graf, dobimo eksponentno krivuljo, a sčasoma v vsakem vzorcu zmanjka materiala za izgradnjo novih kopij DNK, zato se proces zaključi. V tem trenutku smo dosegli fazo platoja.
Če primerjamo krivulje naraščanja količine DNK za različne vzorce, ki smo jih izmerili z isto napravo, lahko ocenimo razliko v količini njihove dednine. Če se krivulja pri vzorcih razlikuje za 10 ciklov, lahko sklepamo, da je bila razlika v koncentraciji izvorne virusne dednine 2 na deseto potenco oziroma za faktor približno tisoč. Če se enak graf ponovi šele po dvajsetih ciklih, je bila razlika v koncentraciji 2 na dvajseto potenco ali za faktor približno milijon.
Testi RT-qPCR za SARS-CoV-2 pomnožujejo vzorec, dokler ne zaznajo dovolj močnega signala fluorescentnega barvila, kar je znak, da so v vzorcu zaznali virusno dednino. V tem primeru je izid testa pozitiven. Če niti po 40 ponovitvah vzorec ne začne svetiti, je to znak, da v vzorcu ni bilo virusne dednine. V tem primeru je izid testa negativen.
Število ciklov PCR, ki so bili potrebni, da je signal presegel mejo zaznave, včasih navedejo tudi na izvidu testa. Količino ciklov, ko fluorescentni signal doseže prag zaznave, imenujemo cycle threshold (Ct) ali quantifiaction cycle (Cq). Dejanski virus, ne le njegovo dednino, je raziskovalcem uspelo izolirati tudi iz vzorcev, pri katerih se je signal pojavil šele po več kot 36 ponovljenih ciklih, zato večina naprav za testiranje postavlja mejo za negativen rezultat pri 40 ciklih. (Zavedati pa se je treba, da je ta meja odvisna od posameznega postopka in ni univerzalno standardizirana.)
Kako deluje antigenski test?
Pri testih, ki delujejo s pomočjo protiteles, uporabimo posebno molekularno lepilo, ki se lahko veže le na virus, ki ga želimo zaznati. Molekularnemu lepilu strokovno rečemo protitelesa, gre pa za posebne molekule, ki imajo takšno zgradbo, da se lahko pripnejo le na značilen del virusa (antigen), ki ga želimo zaznati.
Izvajanje antigenskega testa je podobno opazovanju potoka, po katerem teče voda. Antigenski test je kot naprava, ki jo zgradimo ob potoku, s pomočjo katere lahko zaznamo, ali je v vodi virus. Ker so virusni delci premajhni, da bi jih lahko neposredno opazovali, si pomagamo s protitelesi oziroma z lepilom, ki se lahko prilepi le na virus.
Za izvedbo testa potrebujemo plavajoče kroglice, ki jih lahko brez težav opazujemo, in dve vodni pregradi oziroma ribiški mreži, ki jih postavimo čez potok. Prvo mrežo premažemo z lepilom, ki nase prilepi viruse, ne zadrži pa kroglic, druga mreža pa ne lepi nase virusa, ampak zadrži kroglice. Trik, k ga uporabimo za zaznavanje virusa v vodi je, da tudi kroglice, ki jih spuščamo po potoku, premažemo s tem posebnim lepilom za viruse.
V primeru, če je v vodi virus, se bodo virusni delci vezali na kroglice in kroglice z vezanim virusom na površini se bodo zaustavile ne le na drugi mreži, ki lovi žogice (kontrolna črta C), ampak tudi na prvi mreži, ki lovi viruse (testna črta T). Kroglice se bodo začele nabirati na obeh mrežah, kar ustreza dvema črticama na testu. V tem primeru je test pozitiven, saj je zaznal virus.
Če v vodi ni virusa, se virusi ne bodo prilepili na žogice, zato se žogice ne bodo mogle zaustaviti na prvi mreži, ki je namazana z lepilom za viruse (testna črta T), ampak le na drugi mreži, ki zadržuje žogice (kontrolna črta C). Žogice se bodo tako nabirale le na eni sami mreži, kar ustreza eni črtici na testu. V tem primeru je test negativen, saj virusa v vodi ni zaznal.
Algoritem za interpretacijo testov
Prilagam še prevod sheme, s katero si lahko pomagate pri razumevanju rezultatov hitrih antigenskih testov v različnih okoliščinah. Algoritem so pripravili pri ameriškem uradu CDC, izvorna verzija v angleščini z obsežno razlago pa je na njihovi spletni strani: Interim Guidance for Antigen Testing for SARS-CoV-2.
Super, kratko in jedrnato!